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上篇 实验操作技术3

第一章 核酸分析与分子克隆技术3

一、用PCR扩增目的DNA片段3

二、琼脂糖凝胶电泳9

三、DNA片段的回收10

四、用乙醇沉淀法浓缩DNA样品11

五、目的DNA片段的连接11

六、感受态细胞的制备13

七、质粒DNA的转化15

八、质粒DNA的提取18

九、质粒的酶切20

十、利用Gateway技术构建植物表达载体21

十一、Southern杂交分析21

第二章 蛋白质分析技术23

一、植物组织总蛋白提取及含量的测定23

二、聚丙烯酰胺凝胶电泳24

三、Western blotting分析26

四、Far Western blotting分析28

五、重组蛋白的表达和纯化技术29

六、蛋白兔抗的制备31

七、蛋白互作分析实验技术32

第三章 农杆菌介导的植物转基因操作技术35

一、原理35

二、实验操作流程35

第四章 基因差异表达分析技术40

一、抑制消减杂交40

二、cDNA芯片杂交48

第五章 DNA与蛋白互作分析技术49

一、染色质免疫共沉淀技术49

二、凝胶阻滞分析技术51

下篇 应用实例57

第六章 通路克隆技术入门载体的改造57

一、含有Rubisco小亚基启动子和叶绿体基质定位序列的通路克隆入门载体的构建57

二、通路克隆入门载体pEN-L4*-PrbcS-*T-GFP-L3*的构建63

三、通路克隆入门载体pENTR*-T-GFP的构建及功能验证68

第七章 用Gateway技术构建目的基因的光诱导型植物表达载体75

一、光诱导型GFP基因植物表达载体的构建75

二、光诱导型GUS基因植物表达载体的构建76

三、光诱导型hps/phi融合基因植物表达载体的构建80

四、拟南芥细胞质型苹果酸脱氢酶基因AMDH光诱导型植物表达载体的构建84

第八章 用Gateway技术构建目的基因的组成型植物表达载体89

一、GFP基因植物组成型表达载体的构建89

二、短芽孢杆菌甲醛脱氢酶基因植物表达载体的构建91

三、大豆14-3-3a基因（SGF14a）植物表达载体的构建96

第九章 用Gateway技术构建目的基因与报告基因融合植物表达载体100

一、大豆转录因子GmbHLH30与GFP融合基因植物表达载体的构建100

二、拟南芥RCA启动子和荧光素酶基因LUC融合表达载体的构建及应用104

第十章 用Gateway技术构建目的基因的RNAi干扰植物表达载体113

蚕豆PPlc基因抑制表达载体的构建与应用113

第十一章 用Gateway技术构建串联两个目的基因表达盒的植物表达载体118

二羟基丙酮合成酶和二羟基丙酮激酶基因表达盒串联的植物表达载体构建118

第十二章 用经典的酶切连接技术构建目的基因的植物表达载体128

一、柠檬酸合成酶基因cs光诱导型植物表达载体pPZP211-PrbcS-cs的构建128

二、芹菜丝氨酸乙酰转移酶基因的植物表达载体构建132

第十三章 利用植物表达载体转化植物及转基因植物表型分析136

一、用GFP和GUS植物表达载体产生转基因植物及转基因的整合与表达分析136

二、用植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-hps/phi转化天竺葵获得转基因植株及表型分析141

三、用植物表达载体pK-35S-PrbcS-*T-DAK-PROLD-PrbcS-*T-DAS转化拟南芥获得转基因植株及表型分析145

四、用植物表达载体pPZP211-PrbcS-cs转化烟草获得转基因植株及表型分析156

五、用植物表达载体p1300-Surperpromoter-AgSAT转化烟草及转基因植株表型分析160

六、利用CS和PEPC的表达载体产生双转基因烟草及表型分析163

第十四章 原核表达载体的构建和应用170

一、恶臭假单胞菌谷胱甘肽-非依赖型甲醛脱氢酶的原核表达载体的构建和应用170

二、黑大豆醛脱氢酶基因原核表达载体的构建和应用175

第十五章 酵母表达载体的构建及应用181

AtHSFAld基因在酵母中的表达与功能分析181

第十六章 利用SSH cDNA文库技术分析基因的差异表达185

一、喷施甲醇的蚕豆叶片中上调表达基因的分离与鉴定185

二、甲醛胁迫拟南芥叶片中下调表达基因的分离与鉴定188

第十七章 利用DNA芯片技术分析基因的差异表达191

一、用拟南芥全基因组芯片杂交分析基因的差异表达191

二、用大豆全基因组芯片杂交分析基因的差异表达194

第十八章 利用免疫共沉淀技术分析体内蛋白与蛋白之间的的相互作用199

一、用免疫共沉淀分析铝胁迫下大豆根中14-3-3蛋白对质膜H+-ATPase活性的调控199

二、用免疫共沉淀分析烟草质膜H+-ATPase与14-3-3蛋白的互作对干旱胁迫的应答203

三、用免疫共沉淀分析云南红梨果皮转录因子MYB、bHLH和WD40的互作模式207

第十九章 利用双分子荧光技术分析植物体内转录因子间的相互作用209

在洋葱表皮细胞中验证PyMYB、PybHLH和PyWD40之间的相互模式209

第二十章 用Pulldown和Far Western blot技术做体外实验分析蛋白质之间的互作213

PyMYB、PybHLH和PyWD40重组蛋白之间互作模式分析213

第二十一章 用ChIP分析植物体内转录因子和启动子的结合218

一、云南红梨果皮MYB转录因子结合花青素结构基因启动子元件的分析218

二、甲醇和乙醇刺激对烟草转录因子RSG与GA20oxl启动子结合的影响224

第二十二章 利用EMSA技术做体外实验分析转录因子和基因启动子元件的结合229

EMSA分析在体外PyMYB与花青素合成结构基因启动子的结合229

第二十三章 利用PCR技术筛选拟南芥的T-DNA插入突变体231

一、拟南芥SHMT1纯合T-DNA插入突变体的筛选231

二、拟南芥HY5纯合T-DNA插入突变体的筛选232

三、拟南芥bHLH30纯合T-DNA插入突变体的筛选234

参考文献237

附录240

一、常用抗生素贮存液配制方法240

二、常用培养基的配制241

三、常用菌种的特性244

四、常用质粒载体图谱246

五、转基因生物表型常见生理生化指标的分析方法264