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目录1

序一1

序二1

前言1

第一章 大肠杆菌、质粒和噬菌体1

引言1

第一节 大肠杆菌5

一、培养基的制备和细菌学工具5

二、在液体培养基中培养9

三、在固体培养基中培养10

四、经典的细菌遗传学选择标志12

第二节 质粒24

一、质粒的分子生物学24

二、质粒DNA的小量制备31

三、质粒DNA的大量制备38

四、质粒DNA转化细胞49

第三节 λ噬菌体及其衍生载体55

一、λ噬菌体的分子生物学56

二、λ噬菌体克隆载体60

三、影印λ噬菌体产生空斑72

四、λ噬菌体衍生质粒的培养75

五、从噬菌体裂解物制备λDNA78

第四节 丝状噬菌体载体87

一、丝状噬菌体的分子生物学87

二、M13噬菌体衍生载体的制备与应用92

第五节 黏粒载体100

一、黏粒载体简介100

二、应用黏粒载体构建基因组文库109

三、黏粒文库的扩增和贮存118

主要参考文献125

第二章 DNA的制备与分析127

引言127

第一节 DNA溶液的纯化和浓缩128

第二节 基因组DNA的制备136

一、从哺乳动物组织中制备基因组DNA136

二、从植物组织中制备基因组DNA138

三、细菌基因组DNA的制备141

第三节 大片段DNA的分离与回收146

一、琼脂糖凝胶电泳146

二、脉冲电场凝胶电泳153

三、用琼脂糖凝胶分离和回收大的DNA片段160

第四节 DNA小片段的分离与回收169

一、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳169

二、筛分型琼脂糖凝胶电泳174

第五节 DNA印迹与杂交分析175

一、Southern印迹176

二、DNA的斑点印迹和狭线印迹184

三、DNA印迹的杂交分析188

第六节 寡核苷酸和DNA片段的纯化199

一、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化寡核苷酸199

二、羟磷灰石层析法分离双链和单链核苷酸202

三、阴离子交换层析法纯化DNA204

主要参考文献209

第三章 RNA的制备与分析211

引言211

第一节 真核细胞和原核细胞RNA的制备211

一、组织培养细胞胞质RNA的制备212

二、胍盐法制备总RNA215

三、植物RNA的制备（酚／SDS法）221

四、细菌RNA的制备223

五、带有poly（A）＋RNA的制备229

第二节 RNA结构分析和合成231

一、用单链DNA探针和S1核酸酶分析mRNA232

二、核糖核酸酶保护测定240

三、引物延伸246

四、用Northern与狭线印迹杂交分析RNA248

五、新转录RNA的鉴别255

主要参考文献262

第四章 DNA和RNA的酶学操作263

引言263

第一节 限制性内切核酸酶264

一、限制性内切核酸酶的特性281

二、限制性内切核酸酶消化DNA的方法281

三、影响酶切效率的主要因素285

第二节 限制性作图286

一、多种限制性内切核酸酶消化法作图287

二、限制性内切核酸酶部分消化法作图290

三、末端标记法作图291

第三节 用于修饰与放射性标记核酸的酶292

一、用于操作核酸的试剂和放射性同位素293

二、依赖DNA的DNA聚合酶301

三、不依赖模板的DNA聚合酶312

四、依赖RNA的DNA聚合酶313

五、依赖DNA的RNA聚合酶316

六、不依赖DNA的RNA聚合酶318

七、磷酸酶和激酶318

八、外切核酸酶323

九、内切核酸酶326

十、核糖核酸酶330

十一、DNA连接酶332

十二、RNA连接酶335

第四节 重组DNA分子的构建336

一、DNA片段的亚克隆337

二、PCR构建重组的DNA分子343

第五节 非同位素探针标记及其应用347

一、非同位素探针的标记和比色检测347

二、非同位素探针的化学发光检测353

主要参考文献357

第五章 聚合酶链式反应358

引言358

第一节 PCR的基本原理358

第二节 PCR的基本技术360

一、PCR引物的设计360

二、模板的制备362

三、PCR的基本反应367

四、PCR反应条件的控制与优化368

五、扩增大片段核酸的PCR条件优化370

六、PCR实验中应注意的事项374

第三节 PCR技术的扩展375

一、多重PCR375

二、筑巢式PCR375

三、二次PCR375

四、中断性PCR376

五、共享引物PCR376

六、不对称PCR376

七、反向PCR376

八、彩色PCR377

第四节 用PCR扩增DNA的基本方法378

一、以DNA为模板扩增DNA378

二、以mRNA为模板扩增DNA379

三、筛选最适Mg2＋离子浓度的方案381

四、方法评注382

第五节 用PCR定量分析微量DNA383

一、基本方法383

二、方法评注386

第六节 以低丰度RNA为模板扩增cDNA388

第七节 制备直接用于DNA序列测定的PCR产物391

一、用不对称PCR制备适合双脱氧测序的单链产物391

二、用单个引物再扩增制备适合于双脱氧测序的单链模板392

三、用λ外切核酸酶消化双链PCR产物产生单链的测序模板393

四、制备用于双脱氧测序的双链PCR产物394

五、标记PCR产物进行化学测序395

六、PCR产物的基因组测序法396

一、连接介导PCR的基本原理397

第八节 连接介导PCR与基因组足迹分析和测序397

二、连接介导PCR399

三、从单层细胞制备基因组DNA进行DMS足迹分析404

四、从悬浮细胞制备基因组DNA进行DMS足迹分析408

五、基因组DNA的化学测序反应409

六、方法评注411

第九节 用锚式PCR扩增cDNA414

一、锚式PCR的基本原理415

二、扩增已知序列的3＇端下游区段（下游锚式PCR）417

三、扩增已知序列5＇端上游区段（上游锚式PCR）418

四、方法评注421

第十节 PCR扩增产物的克隆422

一、T-A突出端的产生422

二、利用引物产生半位点423

三、利用引物引入新的酶切位点424

第十一节 用PCR差异显示mRNA425

一、差异显示PCR的基本原理425

二、差异显示PCR的基本方法425

三、方法评注429

主要参考文献430

第六章 DNA导入哺乳动物细胞431

引言431

第一节 DNA转染真核细胞434

一、磷酸钙转染法434

二、用DEAE-葡聚糖转染440

三、用电穿孔转染445

四、脂质体介导的转染449

五、基因稳定转入哺乳动物细胞452

一、融合报道基因概述457

第二节 DNA转染哺乳动物细胞的检测457

二、氯霉素乙酰转移酶（CAT）的收获和测定464

三、萤火虫荧光素酶报道系统分析469

四、人生长激素报道系统测定473

五、β-半乳糖苷酶报道系统测定475

六、转染后RNA的直接分析476

七、转染方法的优化477

第三节 用逆转录病毒载体转导基因480

一、逆转录病毒转导系统概述480

二、特异逆转录病毒产生细胞株的制备485

三、逆转录病毒原种的大量制备与浓缩494

四、逆转录病毒原株中辅助病毒的检测497

五、体外与体内细胞的逆转录病毒感染500

主要参考文献502

一、表达策略504

第一节 蛋白质在大肠杆菌中的表达504

第七章 蛋白质的表达504

引言504

二、T7噬菌体RNA聚合酶／启动子表达系统506

三、融合蛋白表达系统509

四、疑难分析516

第二节 杆状病毒表达系统517

一、杆状病毒表达系统的特点和原理517

二、杆状病毒转移载体521

三、构建重组病毒的策略525

四、杆状病毒克隆表达的新策略528

主要参考文献534

第一节 蛋白质的光吸收法和生物化学法定量535

一、紫外光吸收法535

引言535

第八章 蛋白质分析535

二、Lowry氏比色法536

三、考马斯亮蓝染色法538

第二节 蛋白质的电泳分离539

一、蛋白质的一维电泳分离539

二、蛋白质的二维电泳分离（双相凝胶电泳）554

三、染色凝胶中蛋白质的电洗脱560

第三节 蛋白质的检测562

一、凝胶中蛋白质的染色563

二、印迹到膜上的蛋白质的检测568

三、蛋白质的免疫印迹和免疫检测技术570

第四节 蛋白质的常规层析法纯化582

一、凝胶过滤层析582

二、离子交换层析588

三、免疫亲和层析592

四、金属鳌合亲和层析596

第五节 高效液相色谱分离和纯化蛋白质607

一、反相高效液相色谱608

二、离子交换高效液相色谱614

三、体积排阻高效液相色谱621

四、高效聚焦色谱625

五、高效疏水作用色谱629

第六节 用免疫沉淀法纯化蛋白质632

一、用Sepharose交联抗体免疫共沉淀放射性标记的抗原633

二、Sepharose偶联抗体的制备635

三、用抗Ig血清免疫共沉淀放射性标记的抗原636

四、用抗Ig-Sepharose、A蛋白-／G蛋白-Sepharose或金葡菌菌体免疫共沉淀放射性标记的抗原637

五、使用强力裂解液和洗涤缓冲液进行免疫共沉淀637

六、Sepharose交联抗体与未标记抗原的免疫共沉淀638

七、方法评注639

第七节 专门应用639

一、通过克隆基因的转录和翻译在体外合成蛋白质640

二、蛋白质的生物合成标记技术643

三、用于微序列分析的蛋白质分离方法648

主要参考文献653

第九章 DNA与蛋白质的相互作用656

引言656

第一节 哺乳动物细胞核或细胞质内蛋白的提取659

一、细胞核中提取蛋白质659

二、细胞质部分的提取662

三、方法评注663

第二节 用凝胶电泳进行迁移率改变试验检测DNA结合665

一、低离子强度的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳迁移率改变试验检测法666

二、高离子强度的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳迁移率改变试验检测法668

三、方法评注669

第三节 甲基化和尿嘧啶干扰反应分析蛋白质-DNA的作用671

一、甲基化干扰反应672

二、尿嘧啶干扰实验673

三、方法评注675

第四节 DNase Ⅰ足迹法分析蛋白-DNA结合位点676

一、DNase Ⅰ足迹分析法677

二、光密度及数值分析法对蛋白结合滴定进行定量分析679

三、粗制品的DNase Ⅰ足迹法681

四、方法评注682

第五节 蛋白质与核酸的紫外交联反应682

一、用溴脱氧尿嘧啶核苷替代的探针进行紫外交联反应683

二、用非溴脱氧尿嘧啶核苷替代的探针进行紫外交联反应685

三、原位紫外线交联反应685

四、方法评注686

第六节 用生物素／链亲和素亲和系统纯化DNA结合蛋白687

一、基本方案687

二、用微型柱进行纯化690

四、方法评注691

三、用链亲和素-琼脂糖进行纯化691

第七节 编码DNA结合蛋白cDNA克隆的检测、纯化和鉴定692

一、用识别位点处的DNA探针筛选λgt11表达文库692

二、盐酸胍对干燥的影印膜进行反复变性与复性695

三、从λgt11重组的溶原性细菌的粗提取物鉴定融合蛋白DNA结合活性696

四、方法评注697

第八节 滤膜分离游离DNA及与蛋白质结合的DNA698

一、蛋白质结合DNA的定量测定698

二、DNA结合特异性的检测699

三、结合DNA的洗脱700

四、方法评注700

第九节 体外合成克隆基因蛋白质分析DNA-蛋白质反应701

第十节 序列特异性DNA结合蛋白的亲和层析纯化703

一、基本方案703

二、将DNA偶联于溴化氰活化琼脂糖上706

三、用制备性凝胶电泳纯化寡核苷酸707

四、DNA亲和层析法708

五、非同位素竞争性DNA的选择和制备710

六、方法评注711

主要参考文献711

第十章 蛋白质磷酸化的分析716

引言716

第一节 磷酸化蛋白质的标记和制备717

一、32P标记培养细胞717

二、制备细胞裂解物719

三、SDS煮沸法裂解细胞720

四、免疫沉淀法制备分析磷酸化蛋白质721

第二节 标记的磷酸化蛋白质的检测722

一、SDS-PAGE检测722

二、磷酸氨基酸分析723

第三节 未标记的磷酸化蛋白质的检测726

一、Western Blot检测未标记的磷酸化蛋白质（ECL法）726

二、Western Blot检测未标记的磷酸化蛋白质（125I-蛋白A法）727

第四节 蛋白激酶活性的检测729

一、合成肽检测蛋白激酶活性729

二、快速检测蛋白激酶活性730

第五节 需要特殊仪器的蛋白质磷酸化分析731

一、毛细管电泳法732

二、电喷雾质谱法732

三、HPLC法732

主要参考文献732

第十一章 糖复合物的制备与分析734

引言734

一、糖复合物分析的概述734

三、单糖及寡糖的立体化学和图解表示735

二、技术选择735

四、术语汇编738

第一节 糖复合物及其纯化740

一、糖蛋白及其纯化741

二、蛋白聚糖、糖胺聚糖及其纯化748

三、糖脂及其纯化754

第二节 糖复合物中糖的检测762

一、动物细胞糖复合物代谢性放射标记763

二、氧化反应和硼氢化钠还原反应化学标记碳水化合物772

三、糖基转移酶法分析糖类结构和功能778

四、蛋白质表面糖磷脂锚的检测786

五、酚-硫酸测定己糖与戊糖796

六、N-连接糖基化的抑制798

第三节 糖复合物中糖的释放804

一、涎酸酶（唾液酸酶）805

二、内切性糖苷酶和糖酰胺酶对N-连接寡糖释放810

主要参考文献821

第十二章 免疫学技术823

引言823

第一节 荧光免疫技术823

一、荧光标记技术823

二、荧光免疫测定825

第二节 酶免疫技术829

一、酶免疫技术常用的示踪酶及其底物830

二、酶免疫测定834

第三节 发光免疫测定技术844

一、化学发光免疫测定845

二、生物发光免疫测定847

第四节 生物素与亲和素标记技术848

三、电化学发光免疫测定848

一、生物素与亲和素的生物学特性849

二、生物素与亲和素标记850

三、生物素-亲和素试验系统的基本方法853

主要参考文献855

第十三章 免疫组织化学和原位杂交技术857

引言857

第一节 免疫组化技术的分类858

一、按标记物分类858

二、按染色步骤分类859

第二节 原位杂交技术的分类861

一、按标记物分类861

二、按标记方式分类861

一、培养细胞的免疫荧光染色862

第四节 常用的免疫组化技术862

第三节 免疫组化染色和原位杂交技术中的组织处理862

二、组织切片的免疫荧光染色865

三、组织石蜡切片的PAP过氧化物酶染色技术866

四、组织石蜡切片的ABC碱性磷酸酶染色技术867

五、组织石蜡切片的免疫金银染色技术869

六、组织石蜡切片的酪酰胺信号放大系统染色技术871

第五节 原位杂交技术中分子探针的制备872

一、DNA探针873

二、RNA探针875

第六节 常用原位杂交技术876

一、冰冻切片上的原位杂交技术876

二、石蜡切片上的原位杂交技术880

三、原位聚合酶链反应881

主要参考文献884

一、基因芯片的概念885

第一节 基因芯片885

引言885

第十四章 生物芯片技术885

二、基因芯片技术的基本过程886

三、基因芯片技术的应用890

第二节 蛋白质芯片892

一、SELDI技术892

二、Biacore技术895

三、构象性蛋白质芯片896

第三节 组织微阵列897

第四节 芯片实验室898

主要参考文献899

第十五章 细胞培养技术901

引言901

第一节 细胞培养的基本概念901

第二节 细胞培养的类型与细胞生物学902

一、培养细胞的体内外差异和分化903

二、培养细胞的形态和分类903

三、培养细胞的生长和增殖过程903

四、培养细胞的增殖动力学904

五、培养细胞的遗传学特征904

第三节 培养细胞的生存条件905

一、无污染环境905

二、温度905

三、气体环境和氢离子浓度、渗透压905

四、营养物质906

五、培养基907

六、附着底物907

七、培养用液907

第四节 细胞培养的常用操作技术911

一、细胞系的接种和传代912

二、细胞的洗脱方法913

三、培养血清的测试915

四、细胞计数915

五、细胞活性检测916

六、细胞的低温冻存和复苏917

七、培养基的配制919

第五节 细胞外基质在组织和细胞培养中的作用920

一、细胞外基质成分及其来源921

二、细胞外间质的包被921

三、包被的细胞外基质成分的特征921

四、在EMC成分上培养的细胞的特异性反应922

五、三维细胞外基质对细胞培养的细胞特异性反应923

第六节 培养细胞的生物学污染及其预防检测和排除924

一、工作环境的无菌924

三、无菌技术925

二、器皿的灭菌925

四、细菌和真菌的污染926

五、支原体的检测和清除926

第七节 成纤维细胞的分离与培养928

第八节 上皮细胞的培养930

第九节 人毛细血管内皮细胞分离932

第十节 人淋巴细胞的分离与转化培养935

第十一节 鼠胚干细胞的体外培养与体外分化937

一、鼠胚基成纤维细胞的制备和保存937

二、鼠胚干细胞的培养938

三、鼠胚干细胞的分化培养940

四、未分化的鼠胚干细胞的基因转导941

第十二节 原代神经细胞的分离和培养944

一、海马锥体神经元的分离和培养944

二、鸡胚脊根神经细胞的分离和培养946

第十三节 鸡胚肌母细胞的分离和培养948

第十四节 新生小鼠心肌细胞的分离和培养951

第十五节 成年鼠心室肌细胞的分离和培养953

第十六节 肝星状细胞的培养957

主要参考文献958

第十六章 流式细胞术959

引言959

第一节 用于流式细胞术检测的单细胞悬液制备960

一、贴壁培养细胞的单细胞悬液制备960

二、机械法制备新鲜实体组织的单细胞悬液960

三、石蜡包埋组织的单细胞悬液制备961

第二节 非同步化细胞的细胞周期分析962

第三节 单个细胞细胞周期素的检测963

第四节 评估肿瘤细胞对化疗药物的耐药性964

第五节 单细胞内细胞因子产物检测966

主要参考文献968

第十七章 细胞凋亡的研究方法969

引言969

第一节 细胞凋亡的形态学研究969

一、普通光学显微镜观察969

二、倒置显微镜直接观察971

三、电子显微镜观察971

四、凋亡细胞的碘化丙锭（PI）排斥分析法972

第二节 细胞凋亡的生物化学研究方法973

一、凋亡细胞DNA片段的检测973

二、细胞群染色体DNA断裂的测定975

第三节 细胞凋亡的免疫化学分析方法978

第四节 细胞凋亡的分子生物学研究方法980

一、过氧化物酶标记测定法980

二、荧光素标记测定法982

三、生物素-dUTP／酶标亲和素测定法983

第五节 流式细胞仪检测凋亡细胞的几种常用方法984

一、Annexin V法984

二、TdT法985

三、F-Actin法987

四、Caspase-3法987

五、Sub-G1法989

主要参考文献990

第十八章 转基因动物991

引言991

第一节 转基因技术的基本原理991

一、概述991

二、转基因技术的理论依据992

第二节 转基因动物常用制备方法993

一、转基因动物常用制备方法简介993

二、原核期胚胎的显微注射技术995

第三节 转基因动物的应用1005

一、基因表达调控、基因功能及发育调控作用研究1006

二、基因工程定向育种1007

三、转基因动物生物反应器研制1008

四、人类疾病模型与基因治疗1009

五、药理学研究1010

六、器官移植1010

七、环境科学研究1011

第四节 转基因技术展望1012

主要参考文献1013

附录1016

附录1 细胞分子生物学常用缩写和数据1016

附录2 实验室常用仪器和设备1029

附录3 细胞分子生物学常用操作技术1031

主要参考文献1043