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第一章 绪论1

第一节 基因工程的诞生1

一、基因及基因工程的含义1

二、基因工程诞生的理论基础2

三、基因工程诞生的技术突破2

四、基因工程的诞生与发展3

五、基因工程的主要操作内容和基本技术路线5

第二节 基因工程的安全性及其管理5

一、基因工程对人类健康安全性的影响6

二、基因工程对环境安全性的影响6

三、基因工程引发的伦理道德问题7

四、基因工程安全性评价与管理8

第三节 基因工程的应用11

一、基因工程在农业中的应用11

二、基因工程在工业中的应用13

三、基因工程在医药中的应用14

四、基因工程在环境保护中的应用19

第二章 基因工程的主要技术原理21

第一节 DNA的提取与纯化21

一、质粒DNA的提取21

二、基因组DNA的提取23

三、 DNA的定量和纯度测定24

四、DNA相对分子质量的估计24

第二节 DNA的凝胶电泳24

一、电泳的基本原理24

二、琼脂糖凝胶电泳24

三、聚丙烯酰胺凝胶电泳25

第三节 核酸和蛋白质的分子杂交28

一、Southern杂交28

二、Northern杂交28

三、Western杂交30

四、原位杂交31

五、菌落杂交33

第四节 PCR技术及应用33

一、PCR及其发明33

二、PCR技术的原理34

三、PCR的温度循环过程35

四、PCR的特点35

五、影响PCR扩增的因素36

六、PCR技术的扩展38

七、PCR技术的应用45

第五节 DNA序列分析48

一、双脱氧链终止法48

二、Maxam-Gilbert化学降解法51

三、DNA杂交测序53

四、DNA自动化测序54

五、第二代测序技术55

六、第三代测序技术57

第六节 DNA与蛋白质相互作用分析58

一、凝胶阻滞试验58

二、DNase足迹试验58

三、染色体免疫沉淀技术59

四、酵母双杂交系统59

五、酵母单杂交系统61

第七节 RNA干扰技术64

一、RNAi作用机制64

二、RNAi机制相关基因和酶65

三、RNAi技术的应用65

四、RNAi技术要点66

第三章 基因工程的酶学基础69

第一节 限制性内切核酸酶69

一、限制性内切核酸酶的基本概念和生物学功能69

二、限制性内切核酸酶的命名70

三、限制性内切核酸酶的分类71

四、限制性内切核酸酶产生的末端72

五、影响限制性内切核酸酶酶切反应的因素73

第二节 DNA连接酶77

一、DNA连接酶的基本性质和特点77

二、DNA连接酶的类型77

三、 DNA连接酶的连接反应机制77

四、DNA连接酶的连接反应条件78

五、影响DNA连接酶连接反应的因素78

第三节 DNA聚合酶79

一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ79

二、K l enow片段80

三、T4DNA聚合酶81

四、T7DNA聚合酶81

五、修饰后的T7DNA聚合酶82

六、反转录酶82

第四节 DNA修饰酶82

一、末端脱氧核苷酸转移酶82

二、T4多核苷酸激酶84

三、碱性磷酸酶84

第五节 外切核酸酶84

一、单链DNA外切酶85

二、双链DNA外切酶85

第六节 单链DNA内切酶85

一、S1单链核酸酶85

二、Bal 31核酸酶86

第四章 基因工程载体88

第一节 质粒载体88

一、质粒88

二、质粒载体90

三、经典的大肠杆菌质粒载体93

四、其他质粒载体97

五、质粒载体的稳定性98

第二节 噬菌体载体98

一、噬菌体的一般特性98

二、噬菌体的生活周期99

三、单链噬菌体载体99

四、双链噬菌体载体——λ载体107

第三节 大分子DNA克隆载体113

一、酵母人工染色体113

二、细菌人工染色体115

、人类人工染色体117

四、植物人工染色体118

第四节 病毒载体119

一、CaMV载体119

二、SV40病毒载体120

三、腺病毒载体121

四、反转录病毒载体122

第五节 RNAi载体124

一、VIGS载体125

二、hpRNA表达载体126

第五章 目的基因的获取131

第一节 化学合成法131

第二节 直接分离法134

第三节 体外扩增法135

第四节 文库构建法136

一、基因文库的构建136

二、cDNA文库的构建138

第五节 基于差异表达分离目的基因139

一、mRNA差异显示PCR139

二、消减杂交140

三、cDNA代表性差异分析技术140

四、抑制性消减杂交技术142

第六章 基因的体外重组和转移144

第一节 目的基因的体外重组144

一、目的基因和载体的酶切144

二、酶切DNA的电泳检测与回收145

三、酶切DNA片段的体外连接146

四、重组质粒的验证150

第二节 重组载体导入原核生物150

一、基因工程常用的原核生物150

二、重组载体导入大肠杆菌151

第三节 重组载体导入真核生物154

一、重组载体导入酵母细胞154

二、重组载体导入植物细胞155

三、重组载体导入动物细胞159

第七章 重组子克隆的筛选和鉴定162

第一节 载体表型选择法162

一、抗药性标记及其插入失活选择法162

二、β-半乳糖苷酶α肽互补显色选择法163

三、利用报道基因筛选植物转化细胞164

四、利用遗传选择标记筛选哺乳动物转化细胞166

第二节 插入基因表型选择法167

一、弥补缺陷表型选择法168

二、增加新性状表型选择法168

第三节 DNA电泳检测法168

一、直接电泳筛选法168

二、限制酶酶切电泳筛选法168

三、 PCR扩增电泳检测法169

第四节 核酸分子杂交检测法170

第五节 免疫化学检测法171

一、放射性抗体检测法171

二、免疫沉淀检测法172

三、酶联免疫吸附测定172

四、Western杂交检测172

第六节 转译筛选法173

一、转译筛选173

二、杂交抑制转译法173

三、杂交释放转译法174

第八章 克隆基因的表达175

第一节 外源基因在原核细胞中的表达175

一、原核生物基因表达的特点175

二、原核生物基因表达调控序列176

三、几种类型的原核表达系统177

四、外源基因在原核细胞中高效表达的策略184

第二节 外源基因在真核细胞中的表达187

一、真核生物基因表达调控的特点187

二、真核生物基因表达调控序列187

三、真核表达系统189

第九章 外源基因表达产物的分离纯化194

第一节 重组蛋白分离纯化的原则要求194

一、针对不同形式表达的产物采取不同的处理措施194

二、针对重组蛋白的性质选择不同的分离技术和流程194

三、综合运用多种分离纯化技术195

四、选择适合的分离纯化介质196

五、分离纯化过程的规模化196

第二节 重组蛋白分离纯化的技术原理196

一、层析196

二、高效液相色谱法204

三、气相色谱法205

四、膜分离205

第三节 重组蛋白分离纯化的基本流程208

一、发酵液的预处理208

二、菌体收集与细胞破碎208

三、重组蛋白的粗分离209

四、重组蛋白的精细纯化210

第十章 大肠杆菌基因工程214

第一节 大肠杆菌受体菌株及相关表达载体214

一、大肠杆菌受体菌株214

二、大肠杆菌表达载体215

第二节 大肠杆菌中目的基因的高效表达策略220

一、包涵体型蛋白表达策略220

二、融合型蛋白表达策略221

三、分泌型蛋白表达策略222

四、寡聚型蛋白表达策略223

五、整合型蛋白表达策略224

第三节 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素224

一、胰岛素的结构224

二、重组人胰岛素大肠杆菌工程菌的构建225

第四节 基因工程菌的大规模培养与遗传不稳定性228

一、基因工程菌的大规模培养228

二、影响基因工程菌遗传不稳定性的因素229

三、改进基因工程菌遗传不稳定性的对策230

第十一章 酵母基因工程232

第一节 酵母宿主菌及改造232

一、酵母宿主菌232

二、酵母宿主菌的改造234

第二节 酵母载体系统240

一、酵母载体的一般构件240

二、酵母载体的基本类型241

三、酿酒酵母细胞表面展示表达载体244

第三节 重组子在酵母中的转化、筛选与表达245

一、重组子在酵母中的转化与筛选245

二、重组异源蛋白在酵母中的表达与加工修饰246

第四节 利用重组酵母生产乙肝疫苗249

一、乙肝病毒及其结构249

二、产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母的构建250

三、产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母的构建251

第十二章 高等植物基因工程253

第一节 高等植物的遗传学特征253

第二节 高等植物基因工程受体系统254

一、愈伤组织受体系统254

二、原生质体受体系统255

三、种质受体系统256

四、胚状体受体系统256

五、直接分化芽受体系统257

第三节 农杆菌Ti质粒介导的高等植物转基因技术257

一、Ti质粒的结构与改造258

二、农杆菌载体的构建258

三、Ti质粒介导的整合转化的分子机制260

第四节 高等植物的基因表达系统261

一、外源基因的四环素诱导系统262

二、外源基因的乙醇诱导系统263

三、外源基因的类固醇诱导系统264

第五节 植物转基因技术的应用266

一、利用转基因植物生产药用蛋白266

二、抗虫害的转基因植物267

三、转基因黄金大米269

四、抗除草剂转基因植物育种270

第十三章 哺乳动物基因工程273

第一节 哺乳动物基因工程概述273

第二节 哺乳动物的受体系统274

一、哺乳动物细胞的生物学特征274

二、高效表达外源基因的哺乳动物受体细胞应具备的条件274

三、常用的哺乳动物受体细胞274

四、哺乳动物受体细胞的遗传标记275

第三节 哺乳动物载体系统276

一、质粒型载体277

二、病毒型载体278

三、定向打靶载体282

第四节 哺乳动物细胞的基因导入方法289

第五节 利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白290

一、哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本方法290

二、利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白的实例293

主要参考文献297

索引299