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1 高细胞密度发酵液中治疗用蛋白质产物的收集：原理和实例&Elisabeth Russell,Alice Wang,and Anurag S.Rathore1

1.1 引言1

1.2 原理4

1.2.1 离心4

1.2.1.1 固液分离原理4

1.2.1.2 影响固液分离的因素8

1.2.1.3 澄清效率10

1.2.1.4 关键参数的定义10

1.2.2 过滤12

1.2.2.1 垂直流过滤12

1.2.2.2 切向流过滤18

1.2.2.3 膜污染21

1.2.2.4 关键参数的定义22

1.3 实例：毕氏酵母中表达的治疗用蛋白质的收集23

1.3.1 材料23

1.3.2 方法25

1.3.3 结果与讨论26

1.3.3.1 离心26

1.3.3.2 深层过滤（方法1A）29

1.3.3.3 助滤剂辅助过滤（方法1B）32

1.3.3.4 微滤（方法2）33

1.4 结论36

致谢37

术语37

参考文献37

2 从粗液中捕获产品的膨胀床吸附技术&Alan Sonnenfeld and J？rg Th？mmes41

2.1 引言41

2.2 基本原理42

2.2.1 流态化42

2.2.1.1 实验方法学42

2.2.1.2 流化床的稳定性43

2.2.1.3 生物质存在时床的稳定性测定45

2.2.2 流化床吸附蛋白质的动力学45

2.2.2.1 液侧传质45

2.2.2.2 颗粒侧传质45

2.3 流化床吸附工作曲线图46

2.3.1 整合液侧和颗粒侧传质46

2.4 缓冲液消耗量46

2.4.1 密度置换47

2.5 设备改进47

2.5.1 传统平板分布系统47

2.5.2 替代分布系统48

2.6 案例研究48

2.6.1 工艺开发方法学48

2.6.1.1 流态化49

2.6.1.2 床的稳定性49

2.6.1.3 建模期49

2.6.1.4 小试49

2.6.2 分步举例说明（蛋白A亲和EBA纯化抗体）50

2.6.2.1 流态化50

2.6.2.2 生物质传输51

2.6.2.3 膨胀床的稳定性51

2.6.2.4 吸附动力学52

2.7 结论和展望54

参考文献55

3 高梯度磁钓技术在产品回收中的应用&Matthias Franzreb,Niklas Ebner,Martin Siemann-Herzberg,Timothy J.Hobley,and Owen R.T.Thomas56

3.1 基本概念56

3.1.1 使用无孔磁力吸附剂进行分批吸附56

3.1.2 实例Ⅰ：磁力吸附剂产品结合行为的简单表征57

3.1.3 高梯度磁力分离（HGMS）58

3.1.4 高梯度磁钓技术（HGMF）59

3.1.5 HGMF过程设计62

3.2 适合于HGMF的吸附剂及其使用条件63

3.2.1 磁力载体63

3.2.2 配体的选择66

3.2.3 实例Ⅱ：采用小规模分批实验测定HGMF吸附剂的使用条件67

3.3 磁力分离系统的设计与建立68

3.4 影响系统性能的参数71

3.4.1 概述71

3.4.2 简化吸附率估算71

3.4.3 多组分系统72

3.4.4 实例Ⅲ：容量比的优化74

3.4.5 过程产率76

3.4.6 实例Ⅳ：清洗和洗脱步骤的影响78

3.4.7 吸附剂的重复利用78

3.4.8 实例Ⅴ：中试设备的效率80

3.5 总结81

参考文献81

4 蛋白质复性及其放大&Cynthia Cowgill,Asuman G.Ozturk,and Richard St.John84

4.1 引言84

4.2 复性基础84

4.2.1 增溶85

4.2.2 复性85

4.2.3 二硫键86

4.2.4 复性添加剂86

4.3 复性过程设计87

4.3.1 决定是否复性88

4.3.2 有无纯化的蛋白质？88

4.3.3 目标蛋白质是否含有二硫键？89

4.3.3.1 无二硫键蛋白质的复性89

4.3.3.2 含二硫键蛋白质的复性89

4.3.4 复性的分析90

4.3.5 复性结果和提高复性产率的策略90

4.3.5.1 不溶性产物90

4.3.5.2 可溶性产物91

4.3.5.3 实验设计的应用91

4.3.6 预制的试剂盒91

4.3.7 其他复性方法91

4.3.7.1 分级稀释92

4.3.7.2 渗滤92

4.3.7.3 固相复性92

4.4 复性反应的工艺放大92

4.4.1 复性反应的组成部分93

4.4.1.1 导致蛋白质微观不均一性的因素93

4.4.1.2 组分及对环境健康和安全的关注95

4.4.1.3 盐酸胍和处理设备95

4.4.1.4 原材料的商业供应和费用95

4.4.2 组分的添加和混合95

4.4.3 二硫键和氧传递96

4.4.4 混合与罐的类型101

4.4.5 总结103

4.5 新兴的复性技术103

4.5.1 高压复性103

4.5.1.1 高压复性的机制104

4.5.1.2 高压复性的放大104

参考文献104

5 蛋白质批量结晶——原理与方法&Mark R.Etzel108

5.1 引言108

5.2 蛋白质结晶的原理108

5.3 蛋白质结晶过程开发中需考虑的实际问题110

5.3.1 数据分析方法1113

5.3.2 数据分析方法2113

5.4 应用116

5.4.1 核酮糖-1,5-二磷酸羧化／加氧酶116

5.4.2 枯草杆菌蛋白酶117

5.4.3 抑肽酶117

5.4.4 胰岛素117

5.5 前景119

参考文献119

6 制备色谱技术&Abhinav A.Shukla and Yinges Yigzaw122

6.1 引言122

6.2 色谱的线性保留与非线性保留122

6.3 亲和色谱123

6.3.1 蛋白A亲和色谱及其他基团特异性天然配基124

6.3.2 染料配基亲和色谱124

6.3.3 免疫亲和色谱125

6.3.4 仿生配基125

6.3.5 肽配基125

6.3.6 亲和标记配基126

6.4 非亲和色谱126

6.4.1 离子交换色谱127

6.4.1.1 离子交换色谱建模127

6.4.1.2 离子交换树脂128

6.4.1.3 加样量和结合容量130

6.4.1.4 离子交换色谱的缓冲液131

6.4.1.5 清洗、洗脱用盐的选择131

6.4.1.6 离子交换色谱用于清除杂质132

6.4.1.7 离子交换色谱过程开发的方法学132

6.4.2 疏水作用色谱133

6.4.2.1 疏水作用色谱的理化基础134

6.4.2.2 疏水作用色谱树脂135

6.4.2.3 加样条件的选择136

6.4.2.4 清洗条件的开发137

6.4.2.5 洗脱条件的选择138

6.4.2.6 过程开发方法学138

6.4.3 反相色谱140

6.4.4 羟磷灰石色谱141

6.4.5 固定化金属离子亲和色谱143

6.4.5.1 IMAC树脂与金属离子143

6.4.5.2 IMAC缓冲液145

6.4.5.3 IMAC相互作用建模146

6.4.5.4 IMAC过程开发146

6.4.6 其他技术147

6.4.6.1 嗜硫色谱147

6.4.6.2 疏水性电荷诱导色谱147

6.4.6.3 混合态离子交换剂与硅胶148

6.4.6.4 分子排阻色谱148

6.5 结论148

参考文献149

7 色谱固定相的筛选&Abhinav A.Shuka and Xuejun Sean Han154

7.1 引言154

7.2 树脂筛选154

7.2.1 树脂的选择154

7.2.2 高通量筛选技术158

7.2.3 选择树脂时其他注意事项159

7.3 个案研究：Fc融合蛋白的阳离子交换纯化步骤的开发160

7.3.1 步骤1——确定待筛选树脂160

7.3.2 步骤2——分批容量测定161

7.3.3 步骤3——结合亲和力测定161

7.3.4 步骤4——峰裂分筛选162

7.3.5 步骤5——清除高分子聚集物的选择性163

7.3.6 步骤6——去除溶出蛋白A和宿主细胞蛋白质的选择性163

7.4 结论165

参考文献165

8 从蛋白质结构数据预测色谱分离&Asif Ladiwala,Curt M.Breneman,and Steven M.Cramer166

8.1 引言166

8.2 量化的结构-性质关系166

8.3 QSPR建模基本原理167

8.3.1 分子描述符167

8.3.2 特征选择168

8.3.3 建模技术168

8.4 蛋白质描述符的生成169

8.4.1 MOE描述符169

8.4.2 TAE/RECON描述符170

8.5 SVM建模算法170

8.6 为从蛋白质结构数据预测柱色谱性能而进行多尺度建模：个案研究172

8.6.1 空间质量作用形式173

8.6.2 色谱转运模型173

8.6.3 蛋白质数据集174

8.6.4 QSPR模型的生成175

8.6.5 多尺度模型175

8.6.6 个案研究总结177

8.7 QSPR作为生物工艺开发工具177

8.8 QSPR建模技术的进展和未来方向179

8.8.1 物理可解释描述符179

8.8.2 从一级序列信息获得的QSPR模型180

8.9 结论181

致谢181

参考文献181

9 膜色谱：穿透曲线和病毒清除率分析&Mark R.Etzel and William T.Riordan187

9.1 引言187

9.2 膜色谱原理187

9.2.1 吸附动力学188

9.2.2 质量传递189

9.2.3 流动系统中的混合190

9.3 实验设计与数据分析190

9.3.1 实验步骤190

9.3.2 流动系统中的混合191

9.3.3 质量传递192

9.3.4 吸附动力学及穿透曲线192

9.3.5 规模缩小与放大194

9.4 利用膜色谱清除病毒194

9.4.1 病毒清除应用中模型的改进194

9.4.1.1 不可逆吸附195

9.4.1.2 线性吸附195

9.4.2 模型在设计中的应用196

9.4.3 与文献的比较197

9.5 结论199

参考文献200

10 超滤过程设计与实施&Herb Lutz and Bala Raghunath201

10.1 超滤过程要求201

10.2 超滤技术基本原理202

10.2.1 表面极化203

10.2.2 筛分与截留204

10.2.3 通量204

10.2.4 操作205

10.3 商业化产品208

10.3.1 超滤膜208

10.3.2 超滤组件209

10.4 早期临床阶段过程的开发211

10.4.1 目标与方法211

10.4.2 数据分析212

10.5 放大215

10.5.1 规模调整215

10.5.2 操作规程218

10.5.3 系统要求219

10.6 硬件220

10.6.1 设备选型220

10.6.2 机组布局222

10.7 超滤过程验证与调试223

10.8 故障排除224

10.9 发展前沿224

参考文献225

11 病毒过滤过程设计与实施&Michael W.Phillips,Glen Bolton,Mani Krishnan,John J. Lewnard,and Bala Raghunath227

11.1 背景227

11.2 病毒过滤器的选择228

11.3 过程设计与优化229

11.3.1 垂直流操作230

11.3.1.1 垂直流病毒过滤器231

11.3.1.2 垂直流过滤测试设备与规程231

11.3.1.3 垂直流过滤过程优化233

11.3.2 切向流操作237

11.3.2.1 切向流病毒过滤器237

11.3.2.2 切向流过滤测试设备与规程237

11.3.2.3 切向流过滤过程优化239

11.4 过程模拟与放大240

11.4.1 垂直流过滤240

11.4.2 切向流过滤241

11.5 病毒验证研究242

11.6 过程实施243

11.6.1 硬件要求（设备要求）243

11.6.2 操作流程243

11.6.2.1 过滤器安装244

11.6.2.2 过滤器冲洗244

11.6.2.3 标准化水渗透性的测量244

11.6.2.4 消毒／灭菌244

11.6.2.5 使用前后的完整性测试245

11.6.2.6 蛋白质加工与产品回收248

参考文献248

12 转基因来源的产品回收&Chenming(Mike)Zhiang and Kevin E.Van Cott250

12.1 引言250

12.2 转基因叶类作物中重组蛋白质的初步回收和分离253

12.2.1 用于转基因烟草中蛋白质分离的ATPE253

12.2.1.1 背景和实际考虑253

12.2.1.2 转基因烟草中蛋白质回收的最佳ATPE系统开发的实验方案255

12.2.2 聚合电解质沉淀法纯化转基因烟草中的蛋白质259

12.2.2.1 背景和实际考虑259

12.2.2.2 利用PAA从烟草提取液中沉淀溶菌酶的实验方案260

12.3 转基因动物乳液中重组蛋白质的纯化261

12.4 结论263

参考文献263

13 生物药物开发中的分析策略&Drew N.Kelnerand Mahesh K.Bhalgat269

13.1 引言269

13.2 法规性指南269

13.3 概述270

13.4 制定规范272

13.5 分析检验策略273

13.6 质量属性273

13.6.1 效价273

13.6.2 数量276

13.6.3 产品鉴别276

13.6.4 产品纯度277

13.7 工艺相关杂质278

13.7.1 宿主细胞蛋白质278

13.7.2 宿主细胞DNA279

13.7.3 其他杂质279

13.8 产品相关杂质280

13.9 分子量／粒度分布280

13.10 电荷变体281

13.11 氧化和断裂形式281

13.12 安全性测试282

13.13 产品表征282

13.14 生物物理学分析282

13.15 过程分析技术283

13.16 生物药物的分析检验283

参考文献284

14 纯化工艺中病毒清除的评价&Amitava Kundu and Karl Reindel286

14.1 引言286

14.2 病毒污染导致的健康风险287

14.3 病毒清除研究的理论基础和行动计划287

14.4 病毒清除研究中所用病毒的选择288

14.5 病毒清除研究对需要评价的步骤的选择290

14.6 生产工艺步骤的按比例缩小291

14.7 病毒滴度的估算292

14.8 细胞毒性和病毒干扰试验293

14.9 病毒添加研究的设计293

14.10 病毒清除研究中对数减少因子的计算295

14.11 药物终产品的安全系数的评估296

14.12 用于病毒定量分析的定量聚合物酶链式反应296

14.13 最坏状态的识别297

14.14 色谱柱的消毒和树脂的重复使用298

14.15 病毒清除研究的局限性299

14.16 病毒清除的再评价299

14.17 病毒清除研究的分类通用方法299

14.18 病毒清除研究的多病毒添加方法300

14.19 采用膜吸附剂的病毒清除301

14.20 结语302

附录：采用泊松分布测定病毒滴度302

参考文献303

15 病毒清除技术进展&Kurt Brorson306

15.1 引言306

15.1.1 关键路径计划306

15.1.2 关键与非关键操作参数307

15.1.3 稳健性概念307

15.1.4 简化方法308

15.1.5 病毒添加物质量308

15.2 病毒过滤309

15.2.1 过滤器分类309

15.2.2 过滤器分级309

15.3 物理化学灭活310

15.3.1 溶剂／去污剂处理310

15.3.2 低pH灭活310

15.3.3 热处理311

15.4 色谱311

15.4.1 蛋白A311

15.4.2 离子交换色谱311

15.4.3 介质寿命312

15.5 新型清除／灭活技术312

15.6 新型病毒检测方法——Q-PCR313

致谢313

参考文献313

16 蛋白A亲和色谱技术捕获、纯化单克隆抗体和Fc-融合蛋白：对工艺开发的实际考虑&Sanchayita Ghose,Thomas McNerney,and Brian Hubbard316

16.1 引言316

16.2 单克隆抗体和Fc-融合蛋白316

16.3 单克隆抗体和Fc-融合蛋白的纯化318

16.4 蛋白A亲和色谱319

16.4.1 蛋白A亲和色谱的固定相321

16.4.2 工业化工艺中开发蛋白A色谱步骤的实际考虑323

16.4.2.1 结合容量和工艺产率323

16.4.2.2 洗脱条件326

16.4.2.3 清洗除杂质326

16.4.2.4 蛋白A溶出327

16.4.2.5 树脂的使用寿命327

16.4.3 工艺流程图328

16.5 结论328

参考文献329

17 单克隆IgG的精细纯化方法&Pete Gagnon334

17.1 引言334

17.2 阴离子交换色谱334

17.3 阳离子交换色谱335

17.4 疏水作用色谱336

17.5 陶瓷羟磷灰石338

17.6 整体纯化方案339

17.7 病毒灭活和过滤342

17.8 未来趋势343

17.9 结论344

参考文献344

18 开发和商业化生产中生物药物生产工艺的变更：REMICADE？的历史&Peter W.Wojciechowski,Hendrik I.Smit,Michele M.Myers,Paul J.Voronko,Timothy Laverty,R.Andrew Ramelmeier,and Richard C.Siegel346

18.1 引言346

18.2 Infliximab的结构、功能和制剂346

18.3 Infliximab生产工艺概述347

18.4 开发中的工艺变更和产品可比性348

18.5 商业化生产中的工艺变更和产品可比性351

18.5.1 放大和批准后变更353

18.6 支持工艺变更的申报策略355

19 高黏度流超滤过程的线性放大&Christopher Daniels,Mark Perreault,Brian Gierl,P.K.Yegneswaran,Marshall G.Gayton,David Serway,Ann L.Lee,John Rozembersky,and Narahari S.Puiar357

19.1 引言357

19.2 多糖过程流的超滤及线性放大357

19.3 材料和方法360

19.4 结果和讨论361

19.4.1 系统硬件差别对压力的贡献362

19.4.2 膜盒的结构对压力的贡献364

19.5 结论366

附录：转矩和压力转换为夹紧力366

致谢367

参考文献367

20 膜色谱的应用：一种快速、大容量的基因治疗载体纯化工具&Ajay R.Lajmi,Robert Kutner,and Jakob Reiser369

20.1 引言369

20.1.1 腺病毒载体369

20.1.2 基于腺相关病毒的载体369

20.1.3 慢病毒载体370

20.1.4 质粒DNA370

20.2 载体纯化的最新进展370

20.2.1 腺病毒载体的纯化370

20.2.2 腺相关病毒载体的纯化371

20.2.3 慢病毒载体的纯化372

20.2.4 质粒DNA的纯化372

20.3 膜色谱技术374

20.4 使用阴离子交换膜色谱捕获腺病毒载体374

20.5 使用离子交换膜色谱纯化腺相关病毒载体377

20.6 使用阴离子交换膜色谱捕获慢病毒载体378

20.7 使用膜色谱纯化病毒载体的总体优化策略378

20.7.1 病毒载体的捕获378

20.7.2 动态结合容量379

20.8 下游工程和应用阴离子交换膜色谱捕获质粒DNA379

20.9 小结380

缩写词表380

参考文献381

索引386