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第一篇 概论3

第一章 基因与基因组3

第一节 基因的概念与特性3

一、基因的概念与分子生物学定义3

二、基因的一般特性4

第二节 DNA的结构与性能4

一、核酸的化学组成4

二、DNA的分子结构6

三、DNA的功能与性质7

第三节 DNA的复制与表达8

一、DNA复制8

二、基因表达8

第四节 基因组10

一、病毒基因组11

二、原核生物基因组11

三、真核生物基因组13

四、人类基因组16

第一节 基因工程的基本概念19

第二章 基因工程的基本概念、过程及研究策略19

第二节 基因工程的基本过程及研究策略20

一、目的DNA的制备21

二、载体DNA及其改造22

三、体外DNA重组24

四、重组DNA的转化25

五、重组体的筛选鉴定与克隆扩增27

六、目的DNA在受体细胞中的表达29

第一节 基因工程发展的历史背景31

第三章 基因工程的发展与应用31

一、基因工程发展的关键性理论33

二、基因工程的重大技术发明33

第二节 基因工程的发展与应用34

一、基因工程疫苗与DNA疫苗34

二、基因诊断34

三、基因治疗35

四、基因工程药物36

五、基因工程新技术的开发与应用37

一、人类基因组计划38

二、模式生物的基因组计划38

第三节 人类基因组计划与后基因组时代38

三、人类后基因组计划39

第二篇 基因工程学的基本理论与技术43

第四章 基因工程工具酶及其应用43

第一节 限制性核酸内切酶43

一、限制性核酸内切酶的命名原则43

二、限制性核酸内切酶的分类44

三、Ⅱ型限制酶的识别与切割序列45

四、影响Ⅱ型限制酶作用的因素48

五、限制性核酸内切酶在基因工程中的应用49

第二节 DNA连接酶50

一、DNA连接酶的分类及特性50

二、连接酶催化DNA连接的机制51

三、影响连接效率的因素51

四、DNA连接酶在基因工程中的应用52

第三节 反转录酶52

一、AMV的生化特性53

二、反转录酶催化DNA合成的分子机制53

一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ及应用54

第四节 DNA聚合酶54

三、反转录酶在基因工程中的应用54

二、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow大片段酶55

三、耐热DNA多聚酶56

四、反转录酶56

五、T4DNA聚合酶及T7DNA聚合酶56

六、真核生物的DNA聚合酶57

第五节 碱性磷酸酶57

第六节 单链核酸内切酶——Sl核酸酶58

第七节 末端脱氧核苷酸转移酶58

二、末端转移酶在基因工程中的应用59

一、末端转移酶的生物学功能59

第五章 基因工程的克隆载体61

第一节 概论61

第二节 细菌质粒的生物学特性62

一、质粒的定义62

二、质粒的生物学特性62

三、质粒的分类63

第三节 质粒载体63

一、概述63

二、常用的质粒克隆载体65

第四节 λ噬菌体载体69

一、λ噬菌体69

二、λ噬菌体载体72

第五节 黏粒76

一、基本特征76

二、技术改进77

第六节 M13噬菌体载体78

一、野生型M13噬菌体的生物学特性78

二、野生型M13噬菌体的改造78

三、M13载体系列的优缺点79

四、M13mp18/19的限制图谱和克隆位点序列79

五、主要应用80

六、受体细菌株80

第七节 噬菌粒载体pUC118/11980

一、基本特性80

二、噬菌体载体pUC118和pUC119的主要特性80

四、噬菌体载体pUC118/119的优点81

三、辅助病毒M13K0781

第六章 基因克隆83

第一节 目的基因的获得83

一、已知基因的获得83

二、未知基因的获得85

第二节 基因重组88

一、黏末端连接88

二、平端连接89

三、同聚物加尾法89

四、人工接头连接90

五、T-A克隆91

第三节 重组子导入受体菌91

一、转化92

二、感染92

三、转染92

第四节 目的基因序列克隆的筛选与鉴定92

一、根据重组载体的标志作筛选93

二、DNA限制性内切酶图谱分析93

五、免疫学方法94

六、核苷酸序列测定94

四、PCR法94

三、核酸杂交法94

第七章 原核细胞表达系统95

一、外源基因在原核细胞中的表达95

二、影响外源基因在原核细胞中表达效率的主要因素97

三、原核细胞表达载体的条件及特点98

四、融合型表达载体99

五、非融合型表达载体100

六、分泌型表达载体101

七、表达产物的检测103

八、原核生物表达系统的应用措施及其局限性104

第八章 真核生物表达系统106

第一节 真核生物表达系统概述106

一、真核生物表达系统的优势及必要性106

二、真核生物基因结构及表达调控特点106

三、真核生物表达系统110

第二节 酵母表达系统110

一、酵母载体110

二、外源基因在酵母中的表达策略112

一、哺乳动物细胞表达系统中的常用遗传标记115

第三节 哺乳动物细胞表达系统115

二、哺乳动物细胞表达载体116

三、哺乳动物细胞基因转移方式120

第四节 昆虫杆状病毒表达系统122

一、昆虫杆状病毒载体123

二、在昆虫细胞中表达外源基因124

三、杆状病毒载体系统优势125

一、PCR的基本原理126

二、PCR反应的基本条件及其对PCR的影响126

第一节 PCR的基本原理和影响因素126

第九章 聚合酶链反应126

三、PCR标本的制备130

四、PCR实验中常见问题及对策131

第二节 常用的几种PCR技术131

一、反转录PCR131

二、定量PCR132

三、实时荧光定量PCR133

四、重组PCR135

五、反向PCR135

八、不对称PCR136

六、多重PCR136

七、长距离PCR136

第三节 PCR的应用137

一、PCR在分子生物学中的应用137

二、PCR技术在临床医学中的应用138

第十章 核酸杂交140

第一节 核酸分子探针的标记140

一、探针的种类及其选择140

二、各种标记物及其选择142

三、探针标记方法144

一、核酸分子杂交的类型148

第二节 核酸分子杂交的技术148

二、核酸分子杂交的基本过程150

第十一章 DNA测序153

第一节 DNA序列测定的策略153

一、从遗传图谱、物理图谱到基因组序列图谱153

二、鸟枪法154

三、引物延伸法154

四、套式缺失法154

一、Sanger双脱氧链终止法155

第二节 常用的DNA测序方法155

二、Maxam-Gilbert化学法测定DNA序列157

三、DNA序列分析的自动化159

四、其他的DNA测序方法161

第三节 DNA测序中的常见问题165

第四节 测序的意义165

第十二章 生物芯片技术166

一、生物芯片的概念166

二、生物芯片的分类166

三、生物芯片的基本工作原理167

四、生物芯片的应用172

五、存在问题及发展前景178

第三篇 基因工程学的应用183

第十三章 基因工程抗体183

第一节 基因工程抗体概述183

第二节 人源化抗体184

一、人－鼠嵌合抗体184

二、改型抗体185

第三节 小分子抗体186

二、单链抗体187

一、Fab抗体187

三、单域抗体188

第四节 双特异性抗体188

一、双特异性抗体的发展188

二、BsAb的制备与构建188

一、基本原理189

二、噬菌体抗体库的分类189

第五节 噬菌体抗体189

三、噬菌体抗体的克隆和表达190

四、噬菌体抗体的应用191

五、展望192

第十四章 真核生物基因表达调控194

第一节 真核生物基因表达调控的基本理论194

一、真核生物基因的结构功能特点194

二、真核生物基因表达调控的策略195

第二节 基因表达调控的研究方法200

一、转录前表达调控的研究方法200

二、转录水平调控的研究方法201

第十五章 人类基因诊断与治疗206

第一节 基因诊断206

一、基因诊断的方法206

二、基因诊断的疾病207

第二节 基因治疗207

一、基因治疗的类型208

二、基因转移系统208

三、受体细胞211

四、基因治疗的应用213

五、基因治疗的现状和展望216

第十六章 DNA多态性217

第一节 DNA多态性研究概述217

一、限制性片段长度多态性217

二、微卫星DNA217

三、单核苷酸多态性218

第二节 单核苷酸多态性218

一、单核苷酸多态性的概念218

二、SNP作为遗传标记的优势219

三、单核苷酸多态性的研究意义219

四、SNP检测方法221

五、SNP的网上资源222

第十七章 SEREX方法筛选功能基因223

第一节 SEREX方法原理与技术步骤223

一、SEREX方法原理223

二、SEREX技术步骤223

第二节 SEREX方法所筛选的肿瘤相关抗原基因226

第十八章 基因敲除与转基因技术227

第一节 基因敲除的原理227

第二节 基因敲除的策略227

三、基因敲除载体导入ES细胞228

一、基因敲除载体的设计228

二、基因敲除载体的构建228

四、阳性细胞的筛选与鉴定229

五、基因敲除动物的产生231

第三节 基因敲除的应用及研究进展231

一、基础研究232

二、应用研究232

三、研究进展232

二、转基因技术的策略233

第四节 转基因技术233

一、转基因技术的基本原理233

三、转基因技术的应用236

第十九章 DNA疫苗239

第一节 概述239

一、定义239

二、构建DNA疫苗的基本条件239

三、DNA疫苗制备的基本步骤和方法241

四、常用的DNA疫苗质粒表达载体242

五、DNA疫苗的接种243

第二节 DNA疫苗的免疫原理与应用244

一、DNA疫苗的免疫原理244

二、DNA疫苗的评价与优化245

三、DNA疫苗的应用研究246

第四篇 基因工程实验技术251

实验一 碱变性法提取质粒DNA251

一、质粒DNA的小量制备252

二、质粒DNA的大量制备252

实验二 DNA琼脂糖凝胶电泳254

一、质粒DNA的小量酶切反应256

实验三 DNA酶切及相对分子质量测定256

二、相对分子质量测定257

实验四 DNA的纯化、回收及定量258

一、DNA的纯化258

二、DNA的回收259

三、DNA的定量及纯度测定262

实验五 细胞总RNA的抽提264

一、HBV基因扩增试剂盒检测标本中的HBVDNA269

实验六 聚合酶链反应269

二、RT-PCR（反转录－聚合酶链反应）270

实验七 DNA的连接与转化272

一、DNA连接272

二、重组DNA的转化273

实验八 重组子的筛选与鉴定275

一、重组子的筛选法275

二、重组子的鉴定276

一、DNA探针标记与斑点杂交278

实验九DNA探针标记及核酸杂交技术278

二、Southern印迹杂交281

三、Northern印迹杂交282

实验十 从组织中提取人基因组DNA284

实验十一 基因转染哺乳动物细胞286

一、电穿孔法286

二、脂质体介导的转染287

实验十二 蛋白质印迹技术289

实验十三 原位杂交292

实验十四 PCR-SSCP技术294

实验十五 核酸电镜技术296

实验十六 表达谱DNA芯片样品的标记及杂交实验方案298

附录302

附录Ⅰ 常用玻璃器皿的处理302

附录Ⅱ 常用培养基和溶液303

附录Ⅲ 基因工程常用数据和换算计算公式305

附录Ⅳ 人类基因组测序参加单位索引309

附录Ⅴ 专业词汇（英中对照）310

附录Ⅵ 常用专业名词与解释（英文）315

附录Ⅶ 参考文献328