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简介1

实验1 全细胞裂解物的双向凝胶电泳和MALDI质谱分析11

操作程序1-1 酵母细胞裂解液的制备15

操作程序1-2 IPG胶条的再水化和等电聚焦16

操作程序1-3 等电聚焦胶条的平衡20

操作程序1-4 第二向——SDS-PAGE21

操作程序1-5 用SYPRO Ruby进行全蛋白染色23

操作程序1-6 用Pro-Q Diamond进行磷酸化蛋白染色24

操作程序1-7 用Pro-Q Emerald进行糖蛋白染色24

操作程序1-8 用考马斯亮蓝进行全蛋白染色25

操作程序1-9 用质谱兼容的银染进行全蛋白染色26

操作程序1-10 2D胶的图像分析和蛋白质回收26

操作程序1-11 胶内酶切28

操作程序1-12 MALDI点靶29

实验2 用于质谱分析的蛋白质复合物的纯化32

操作程序2-1 培养并收集TAP标记的酵母细胞33

操作程序2-2 为纯化TAP标记蛋白质复合物制备酵母细胞抽提物35

操作程序2-3 第一步亲和富集——利用IgG亲和色谱从酵母抽提物中捕获TAP标记的蛋白质复合物37

操作程序2-4 第二步亲和富集——TAP-标记的蛋白质复合物的钙调蛋白亲和色谱40

操作程序2-5 与磁珠的结合42

操作程序2-6 蛋白质复合物的亲和纯化45

实验3 用MALDI TOF/TOF串联质谱进行肽的定性和定量分析49

操作程序3-1 实验描述50

实验4 蛋白质复合物分析——高灵敏液相色谱与串联质谱联用60

操作程序4-1 HPLC柱毛细管的制作61

操作程序4-2 填装微毛细管FSC柱64

操作程序4-3 微毛细管RP-HPLC与ESI-质谱联用67

实验5 用IMAC和质谱分析磷酸化肽72

操作程序5-1 制备IMAC样品73

操作程序5-2 制备IMAC柱和反相捕获柱（前柱）75

操作程序5-3 制备IMAC柱76

操作程序5-4 样品处理77

实验6 全细胞裂解物的多维蛋白质鉴定技术分析81

操作程序6-1 使用多维蛋白质鉴定技术分析全细胞裂解物83

实验7 全细胞提取物的定量质谱检测技术（iTRAQ）88

操作程序7-1 从酵母细胞制备肽91

操作程序7-2 以iTRAQ试剂标记肽93

操作程序7-3 应用反向色谱柱提纯肽94

操作程序7-4 多肽等电聚焦95

实验8 串联质谱数据的分析及确认100

操作程序8-1 使用Global Proteome Machine系统分析LC-MS/MS数据104

操作程序8-2 使用ProteinPilot软件进行肽段和蛋白质鉴定112

操作程序8-3 对数据库检索程序鉴定为能够匹配肽段序列的MS/MS谱图进行评价118

实验9 开放阅读框的高通量克隆——构建大量表达结构125

操作程序9-1 利用Gateway LR反应构造表达结构129

操作程序9-2 用Gateway LR反应产物化学转化感受态细菌130

实验10 蛋白质微阵列的构建——核酸可编程性蛋白质阵列134

操作程序10-1 用氨基甲硅烷包被载玻片139

操作程序10-2 在96孔板中制备细菌的培养物139

操作程序10-3 从96孔板中分离质粒DNA142

操作程序10-4 DNA的生物素化、沉淀及样品布阵145

操作程序10-5 NAPPA载玻片上蛋白质的表达147

操作程序10-6 检测NAPPA载玻片上的蛋白质149

操作程序10-7 在NAPPA芯片上测定DNA151

实验11 使用核酸可编程性蛋白质阵列鉴定蛋白质-蛋白质相互作用153

操作程序11-1 NAPPA芯片与查询蛋白共表达154

操作程序11-2 在NAPPA芯片上检测查询蛋白156

附录1 钠升电喷雾电离离子源和串联质谱装置和示范159

附录2 溶液内蛋白质的消化164

附录3 凝胶内胰酶消化已分离蛋白167

附录4 三氯乙酸蛋白质沉淀法170

附录5 氨基酸的单同位素和亚铵离子分子量171

附录6 氨基酸二肽分子量172

附录7 LTQ离子阱的使用方法173

附录8 肽段混合物离线去盐180

附录9 感受态细胞的制备183

附录10 DNA的定量185

附录11 注意事项186

索引193